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今天推送的文章是发表在***CS Catalysis上的

“Computational Studies Devoted to the Catalytic Mechanism of Threonine ***ldolase, a Critical Enzyme in the Pharmaceutical Industry to Synthesizeβ?Hydroxy-α-amino ***cids”，通讯作者是波尔图大学的Nuno M. F. Sousa ***. Cerqueira。

苏氨酸醛缩酶（T***）是广泛分布于自然界的依赖于吡哆醛-5’-磷酸(PLP)的酶。T***催化苏氨酸反醛醇裂解为甘氨酸和乙醛。它还催化乙醛和甘氨酸缩合形成具有两个手性中心的苏氨酸的可逆反应(图1)。由于T***的可逆活性，它是形成不对称碳?碳键的强大催化剂，能够以甘氨酸和不同的醛为原料合成多种β-羟基-α-氨基酸(H******s)。H******s是一组具有两个手性中心的分子，是几种药物的重要组成部分，如抗生素、免疫抑制剂和抗帕金森病药物L-苏氨酸-3，4-二羟基苯丝氨酸(L-threo-DOPS)。然而，苏氨酸的合成一直是一个挑战，因为它要求很高，而且往往会导致立体异构体的混合。考虑到这些困难，T***被视为以高效、安全和环境友好的方法合成H******s的绝佳机会。在过去的十年里，人们已经进行了几项研究，以将T***用作合成H******s的催化剂。然而，仍有必要优化底物专一性和反应产物的立体选择性。

图1

实验结果表明，L-别苏氨酸和L-苏氨酸的全催化反应速率(Kcat)分别为3.55和1.87s^-1。本文研究了以L-苏氨酸和L-别苏氨酸为底物，用原子分辨率充分描述了L-T***从外部醛亚胺1到外部醛亚胺2的催化机理，并计算了吉布斯自由能分布。这些结果使我们能够了解哪些残基在催化过程中充当碱基，并为PLP辅助因子在催化过程中的重要性提供了新的见解。

使用QM/MM方法以原子分辨率研究了 L-苏氨酸醛缩酶与L-别苏氨酸和L-苏氨酸的催化机制。结果表明，两种底物的机理非常相似。整个过程由PLP控制，它位于活性位点并与底物共价结合。PLP是维生素B6的生物活性形式，它是通过激酶和氧化酶对吡哆醇 (PN)、吡哆醛 (PL) 和吡哆胺 (PM) 的作用而产生的。PLP是多种酶的酶辅因子，其中包括T***。一旦PLP进入PLP依赖性酶的活性位点，它就会与活性位点Lys残基（在T***的情况下为 Lys199^B）反应并形成内部醛亚胺（图2）。一旦底物可用，它就会与内部醛亚胺反应并形成外部醛亚胺。在这个过程中，底物与PLP辅因子共价键合，辅因子和Lys199^B之间的键被裂解。本文的出发点是外部醛亚胺，其结构快照可以从共结晶X射线结构1LW4中检索。将内部醛亚胺转化为外部醛亚胺1是所有PLP依赖性酶的特征步骤。该步骤之前已被广泛研究，其中测试了几种设想和假设，更有利的一个特征是低游离能量屏障，包括实验观察到的所有中间体的形成。

图2

因此，两种催化机制都始于所有 PLP 酶促反应的共同反应中间体，即外部醛亚胺1 (E***1)。在PLP酶中，这种中间体仅在与PLP辅因子结合的底物类型和底物与活性位点建立的相互作用类型不同，而这取决于酶催化的反应。在T***的情况下，外部醛亚胺 (E***1) 具有与 PLP 辅因子共价键合的 L-苏氨酸或 L-别苏氨酸。在该中间体的优化几何结构中，E***1（与 L-苏氨酸或 L-别苏氨酸）与活性位点的残基建立了几种相互作用，这对于羟基的正确排列和取向至关重要，并使其为催化过程做好准备. ***rg316^B通过与E***1的羧酸盐基团形成的盐桥使底物定向。***sp168^B通过另一个盐桥锚定吡啶PLP环。His83^B进行了一个π-π堆叠相互作用，PO3 基团由几个水分子和 Gly58^B和Thr59^B提供的两个氢键稳定。Lys224^C和His125^D密封活性位点，使底物保持在原位。

L-苏氨酸醛缩酶的催化机制。第一步：E***1 羟基的去质子化。此步骤涉及从 E***1 到活性位点残基的质子转移。观察活性位点附近，可在此步骤中发挥该作用的残基是His125^D、Lys224^C和PLP的磷酸基团（图4）。本文对这些假设中的每一个进行了评估，并在以下各节中对其进行了详细描述。在设想1中，His125^D应该像一个碱基一样，在从水分子中接收质子后变成双质子化并带正电。然而，由于His125^D过于暴露于溶剂中，因此周围环境中没有残留物能够稳定这种电荷。在 QM/MM 计算期间观察到这种缺乏稳定性，其中该反应的模拟（通过线性扫描）导致非常高的活化能（高于31 kcal/mol）并且没有识别出过渡态。

图4

另一方面，设想2和3都揭示了在生理条件下可能发生的较低吉布斯活化能。这两种机制非常相似，仅在催化过程的第一步和第三步中涉及的质子受体不同。在设想2中，它是Lys224^C，在设想3中，它是PLP的磷酸基团。然而，发现这些残基都不能直接作为碱基，需要水分子 (W***T1) 的存在来调节质子与E***1的转移。设想2和3的催化机制始于两个同时提取的质子。一个涉及N5或O6（分别来自设想2或3）到 W***T1，W***T1 反过来从 E***1 的羟基O3中去除一个质子。在反应结束时，氧气O3带负电（平均-0.813 au）。

两种反应的过渡态都以一个假想频率为特征（方案2中为235.6i cm^-1，设想3中为 784.4i cm^-1），如图5所示。E***1现在更接近水分子（d_H(O3)-O4平均为1.28，而反应物中为1.61?），与水键合的质子现在与最终的质子受体共享（d_H(O4)-N5/O6平均为1.18，而反应物中为1.64?）。在这一步骤的产物中，在反应物中与水结合的质子现在与N5或O6(d_N5/O6-H(O4)平均1.06?)成键。这意味着在设想2中，Lys224^C变成正电荷，而在设想3中，PO3基团的形式电荷从?2变成?1。在这两种情况下，E***1的O3变成负电荷(平均?0.813 ***u)。在每种情况下，该反应的自由能量分布非常相似，需要较小的吉布斯自由激活势垒，而且两者都是赋能的。从动力学和热力学的角度来看，设想2的反应是有利的(图5)。

图5

第二步：共价键断裂。催化过程的第二步涉及C1和C2之间的键Cα?Cβ的裂解，产生醌类中间体。这种反应对于设想2和设想3是相同的，唯一不同的是，在设想2中，Lys224^C是正电荷，PO3基团具有?2的形式电荷，而在设想3中，Lys224^C是中性的，PO3基团具有?1的形式电荷。这些反应的过渡态是由设想2的118.2i cm^?1和设想3的222.5i cm^?1的一个虚数频率表征的(图6)。在这两种情况下，两个碳之间的距离现在更大(d_C1?C2平均为2.23，而反应物为1.64?)，有利于键的断裂。在这一步的产物中，催化过程的第一个产物(乙醛)被释放出来，并与带负电荷的C1(平均?0.355 ***u)形成醌类中间体。在这两种情况下，这个反应都需要一个很小的自由活化势垒，而且是吸能的。在这种情况下，从动力学和热力学的角度来看，设想3的反应是有利的(图6)。

图6

第三步：水解作用。催化过程的第三步也是最后一步需要存在额外的水分子。 该步骤涉及醌类反应中间带负电荷的 C1 对第二个水分子的质子的亲核攻击，该质子从另一个水中获取一个质子，进而从第一步的最终受体中去除质子。在该反应结束时，得到E***2。该反应中间体与E***1不同，因为它现在具有与PLP共价键合的甘氨酸，而不是在反应物中发现的L-别苏氨酸。

图7

该反应的过渡态具有单一的虚频率(设想2中的985.0i cm^?1和设想3中的1004.7i cm^?1)(图7)。与第二个水分子结合的质子现在位于C1的中间(反应物中的d_H(O7)?C1平均为1.34?，反应物中为1.95?)。在这个反应的产物中，与第二个水结合的质子现在与C1结合，两个水分子以及最后一个质子受体的原始电荷重新建立，导致E***2，其中PLP共价连接到甘氨酸。

L-别苏氨酸和L-苏氨酸的催化机理基本相同。当形成E***1时，活性中心没有空间位阻地接受两种底物，并且所有残基几乎都重叠在两种络合物中。这一趋势的唯一例外是两种底物与Tyr87^B的相互作用。在L-别苏氨酸的情况下，CH3基团与酪氨酸对齐，而在L-苏氨酸的情况下，CH3基团与氢对齐。在这两种情况下，我们都有一个极性基团与一个非极性基团相互作用。然而，在L-别苏氨酸的情况下，这个基团略大，这可以证明略低效率的能量分布是合理的(图8)。

图8

完整的催化机理如图9所示，分三个步骤进行：(i)E***1羟基的去质子化；(ii)共价键断裂；(iii)水解。从图10中给出的能量分布，我们可以清楚地得出结论，催化机理可以遵循设想2和设想3。从动力学和热力学的角度来看，第一步在设想2中比设想3更有利。但是，第二步在设想3中更有利。基于这一数据，我们认为催化反应应该主要通过设想3进行，这是磷酸基团的自助式反应。

图9

图10

END

文章信息：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.1c05567?ref=pdf

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